Ecole µSB

La présente école de microscopie, piloté par le Groupe de Travail IMAGERIE Bois du GDR3544 « Sciences du bois » se déroulera les 23-25 mai 2018 à l’Université de Limoges. Cette école sera organisée autour de 3 ateliers portés par 3 plateformes de l’Université de Limoges. Chaque atelier rassemblera 6/7 personnes selon:

·       La microscopie confocale de la plateforme BISCEm de l’institut GEIST sur le site Marcland,

·       La microscopie vibratoire de la plateforme PLATINOM du laboratoire XLIM sur le site de La Borie

·       La microscopie électronique de la plateforme Microscopie électronique du laboratoire SPCTS sur le site Ester-Technopôle.

Chacune de ces 3 technologies sera présentée au cours de la première journée (programme). S’en suivra une répartition des stagiaires en 3 groupes qui tourneront sur les 3 ateliers proposés. Le travail en petits groupes, avec un chercheur et/ou un ingénieur machine sera l’occasion de voir et d’analyser des échantillons de bois sous un angle différent des techniques usuellement utilisées par chacun d’entre nous dans nos laboratoires respectifs. La dernière journée sera consacrée à l’intégration de ces technologies dans les projets de recherche des stagiaires afin de connecter la ou les problématiques de chacun aux technologies d’imagerie du bois.

1-La microscopie Confocale

La microscopie confocale permet de réaliser des images hautement résolues restreintes au plan de focalisation, soit quelques centaines de nanomètres. Il est devenu possible d’étudier l’organisation des cellules en trois dimensions ; les notions de localisation intracellulaire et de co-localisation de molécules ont fait leur apparition.
L’utilisation des protéines fluorescentes ( GFP, YFP, CFP) couplées à des molécules d’intérêt et intégrées de manière stable ou transitoire dans le génome d’une cellule ou d’un organisme ainsi que l’ajout de chambres d’incubation sur les microscopes permettant la régulation de la température et de l’apport en CO2 permettent de plus l’observation d’une cible in situ au cours du temps, on parle alors d’observations en 4 dimensions.
L’imagerie spectrale
S’ajoutent aux améliorations des systèmes optiques des avancées majeures au niveau des détecteurs utilisés en microscopie. De nouvelles générations de détecteurs dits spectraux ouvrent de nouvelles possibilités quant au nombre de signaux de fluorescence détectables simultanément sur un même échantillon : il s’agit de l’imagerie spectrale.
Classiquement, un signal fluorescent est détecté par un microscope grâce à un filtre qui ne laissera passer que la lumière émise par un fluorochrome donné vers le détecteur du système. Les contraintes techniques de ces filtres entrainent une limitation du nombre de fluorochromes que l’on peut détecter en même temps, et par là même du nombre de molécules observables simultanément. L’imagerie spectrale permet d’identifier spécifiquement les spectres d’émission de fluorochromes en s’affranchissant de l’utilisation de filtres de fluorescence. Cette nouvelle approche permet d’augmenter le nombre de signaux fluorescents détectables simultanément et/ou d’identifier un signal dû à un phénomène d’autofluorescence, soit pour s’en affranchir soit pour la mettre à profit.
La macroscopie confocale
Enfin de nouveaux outils permettent l’observation d’échantillons épais et en champs large, mais à haute résolution.

2-La macroscopie Confocale

Le macroscope confocal est un microscope à faible grossissement équipé d’un système confocal pour l’acquisition d’images très bien résolues en champs large et en 3 dimensions permettant des études macroscopiques tout en conservant une résolution sub-microscopique.
Un tel équipement permet l’analyse de petits organismes (le poisson-zèbre par exemple), des explants tissulaires, des biomatériaux , des greffes de tumeurs, des plantules

1-La microscopie biphotonique

La microscopie non linéaire a été largement diffusée à partir des année 90 grâce à Denk et collaborateurs, dont les travaux portaient sur l’imagerie à 2 photons et les réactions photochimiques induites dans des cellules biologiques. De nos jours, la microscopie non linéaire en biologie utilise principalement la technologie de laser femtoseconde (100fs) dans l’infrarouge (700-1300 nm) pour de l’imagerie à fluorescence, de la génération de second harmonique (SHG) ou de troisième harmonique (THG).
La microscopie multiphotonique (ou encore « biphoton ») permet de contrecarrer certains inconvénients que présentent la microscopie confocale, en limitant la photo-toxicité cellulaire (photo-blanchiment) et en autorisant une plus grande pénétration dans l’épaisseur du tissu (de quelques dizaines de µm à plusieurs centaines), aussi bien in vitro qu’in vivo. Cette technologie autorise l’observation microscopique en temps réel des molécules et des activités biologiques in situ dans un environnement fonctionnel, avec une résolution spatiale et temporelle maximale, en interférant au minimum avec les structures biologiques. Elle donne par ailleurs accès à de l’imagerie 3D par reconstruction à partir des sections optiques. Il est important de savoir que les spectres d’émission des fluorochromes sont généralement plus étalés en excitation biphoton qu’en monophoton, à l’exemple des protéines fluorescentes dérivées de la GFP (eGFP, YFP, CFP, …). D’autre part, certains fluorochromes ne respectent pas le principe d’une excitation efficace à ʎ/2 de la longueur d’onde infra-rouge utilisée, et chacun se doit d’être systématiquement testé en mode biphoton. Il est alors possible d’exciter simultanément ces fluorochromes par une seule longueur d’onde du laser pulsé et observer des compartiments tissulaires ou cellulaires bien séparés. 

2-La microscopie RAMAN

La diffusion Raman stimulée est un processus non linéaire induit par la propagation de rayons laser intenses dans des milieux non linéaires. Cet effet peut être compris comme un transfert d’énergie d’un champ de pompe vers un autre champ dont la fréquence est rétrogradée d’une valeur déterminée par les modes de vibration du milieu. Combiné avec d’autres processus, ce phénomène non linéaire est exploité dans les fibres trouées pour la génération de continuum, dans lequel il participe largement à l’agrandissement spectral. Néanmoins, sa contribution à la propagation non linéaire induit un élargissement spectral non homogène avec de grandes modulations qui limitent l’utilisation du signal large bande généré. On sait que le SRS peut être fortement affecté par des processus paramétriques tels que le mélange à quatre ondes (FWM) ou les instabilités de modulation (MI). Après la première étude de Shen et Bloembergen, de nombreux articles ont montré l’interaction entre l’effet Raman et les processus de mélange non-linéaire. Par exemple, il a déjà été démontré que le gain Raman effectif peut être supprimé par le couplage entre Stokes et les ondes anti-Stokes, ce qui se produit pour une valeur relativement faible du désaccord de vecteur d’onde linéaire avec la pompe. De plus, nous pouvons noter que l’influence du gain paramétrique a été analysée et observée dans les fibres bimodales dans des conditions de pompage à fréquence unique en régime de dispersion normale. Dans cette étude, l’appariement de la phase modale entre le fondamental et le premier mode transversal d’ordre élevé de la fibre pourrait induire un effet MI causant une forte perturbation dans la croissance du SRS.
Enfin, l’annihilation Raman a été démontrée en utilisant un schéma de pompage double. Premièrement, les deux fréquences non dégénérées étaient polarisées orthogonalement. SRS a ensuite été supprimé dans un axe d’une fibre hautement biréfringente à travers les composantes orthogonales de la non-linéarité Raman. Plus tard, la suppression du SRS pur non paramétrique a été démontrée en utilisant l’effet combiné du gain de Raman Stokes et des processus d’absorption Raman anti-Stokes avec une polarisation parallèle des deux ondes d’entrée. Néanmoins, parmi tous ces articles publiés, aucune suppression d’une cascade Raman complète en régime de grande dispersion normale n’était, à notre connaissance, déjà observée.

1-LFEI ESEM QUANTA 450 FEG

Depuis une dizaine d’années, l’ESEM (Environmental Scanning Electron Microscope) constitue pour les matériaux biologiques, une avancée importante résolvant les problèmes de préparation d’échantillons. Pour les observations au microscope électronique à balayage conventionnel, les échantillons doivent être déshydratés et rendus conducteurs. La phase de déshydratation constitue un véritable obstacle à une caractérisation in situ des échantillons.
L’avantage principal d’un ESEM par rapport aux microscopes conventionnels réside dans le fait qu’il peut fonctionner à des pressions allant jusqu’à 4000Pa et à des températures d’échantillon contrôlées par une platine Peltier, ce qui permet l’observation directe d’échantillons hydratés. Avec la platine Peltier, il est possible de réaliser des cycles afin de faire varier l’humidité pour caractériser la morphologie de l’échantillon et la distribution de la phase avec des conditions d’humidité relative différentes.
Par ailleurs, les nouveaux dispositifs de contrôle du faisceau d’électrons et de détection permettent de former des images à basse tension, et par conséquent d’observer des échantillons non conducteurs sans une métallisation préalable de leur surface. Le pilotage précis des conditions de température et de pression dans la chambre du microscope permet également de suivre en dynamique des variations d’humidité ou de changement d’atmosphère gazeuse.
Le microscope est équipé d’un spectromètre dispersif en énergie (EDS). Les études en microanalyse X permettent une détermination qualitative des composants chimiques élémentaires présents dans un échantillon (depuis l’élément Bore) et les applications sont nombreuses : détermination des charges et substances minérales dans la masse, analyse des couches, profil de répartition des éléments dans l’épaisseur, cartographie de répartition des charges

2-Le ZEISS Crossbeam 550

Le microscope double faisceau ZEISS Crossbeam 550 est équipé d’une colonne GEMINI avec un canon à effet de champ (FEG) et d’une colonne ionique source Gallium Capella » permet d’abraser la matière localement et de manière précise à l’échelle du micromètre voire du nanomètre tout en visualisant au MEB la zone d’intérêt au cours de l’usinage.
La source ionique est une source de Ga+, des ions lourds pouvant être accélérés entre 1kV et 30kV. La colonne ionique permet d’obtenir un faisceau d’ions focalisés (FIB = Focused Ion Beam).
Cet instrument est également équipé d’un système de dépôt (GIS) local métallique (W ou Pt) ou isolant (SiO2) permettant de protéger la zone d’intérêt de l’abrasion.
Les micromanipulateurs sont classiquement des pointes fines en tungstène. Cet accessoire permet de manipuler des objets micrométriques.
Cet instrument avec ses accessoires est très versatile et permet de répondre à de nombreuses applications. Quelques-unes sont citées ci-dessous :
Obtention de la section transversale d’un échantillon dans une région d’intérêt précise
Préparation d’une lame mince pour des observations MET
Reconstruction 3D d’un volume de matière : Le principe est de réaliser des abrasions successives d’une zone d’intérêt et d’imager chaque coupe transverse. Une pile d’images est ainsi réalisée. Une reconstruction du volume de matière est effectuée par des logiciels de traitement d’images spécifiques.
Micromanipulation d’objets : Cet équipement permet à l’aide des micromanipulateurs de déplacer des objets.
Le microscope est équipé d’un spectromètre dispersive en énergie et d’un système EBSD. Les études en microanalyse X permettent une détermination qualitative des composants chimiques élémentaires présents dans un échantillon (depuis l’élément Bore) et les applications sont nombreuses : détermination des charges et substances minérales dans la masse, analyse des couches, profil de répartition des éléments dans l’épaisseur, cartographie de répartition des charges. Les applications de la technique EBSD sont, entre autre, la détermination des orientations cristallographique (textures) et de leur distribution, la caractérisation de la microstructure (tailles et formes de grains), la classification des joints de grains en fonction de leur mésorientation, la visualisation des champs de déformation, l’identification des phases.